Θα θέλαμε να αποκτήσουμε δύο συμπληρωματικά μικροσκοπικά συστήματα για την εκτέλεση παρατηρήσεων σε ζωντανά κύτταρα, επιτρέποντας φυσιολογικές εξετάσεις. Το σύστημα σάρωσης με λέιζερ (CLSM) παρέχει εξαιρετικές ευκαιρίες για χειρισμούς και μετρήσεις φθορισμού (φωτοενεργοποίηση, φωτομετατροπή, φωτολεύκανση, μεταφορά ενέργειας συντονισμού Förster (FRET))· η ιδιαιτερότητα της εγγραφής σήματος αυξάνεται με φασματική ανίχνευση. Σε αυτό το σύστημα, μπορούμε να επικεντρώσουμε τις δοκιμές στις μικρότερες περιοχές μέσα στο οπτικό πεδίο, προαιρετικά καθορισμένες. Με το μικροσκοπικό σύστημα περιστρεφόμενων δίσκων (SD), μπορούμε να καταγράψουμε μοριακές διεργασίες σε ζωντανά κύτταρα ακόμα πιο γρήγορα από το σύστημα CLSM, ακόμη και με ρυθμό καταγραφής εικόνας χιλιοστό δευτερολέπτου, σε ολόκληρο το οπτικό πεδίο. Μια σημαντική πτυχή είναι ότι τα ζωντανά κύτταρα υπόκεινται σε λιγότερη έκθεση στο φως κατά τη διάρκεια των εγγραφών, έτσι ώστε να μπορούμε να συνεχίσουμε τις παρατηρήσεις για πολύ περισσότερο. Το προς προμήθεια σύστημα SD είναι επίσης κατάλληλο για την εμφάνιση μοριακών διεργασιών σε άμεση γειτνίαση με την επιφάνεια του κυττάρου (σε απόσταση 100-150 nm) με αυξημένη ανάλυση και υψηλή ταχύτητα σε σύγκριση με τις δοκιμές CLSM (TIRF, δηλαδή πλήρης εσωτερική μικροσκοπική ανάκλαση). Και τα δύο συστήματα είναι ικανά να καταγράφουν δύο σήματα φθορισμού ταυτόχρονα με 2 ανιχνευτές (CLSM) και 2 κάμερες (SDs), έτσι ώστε οι μοριακές αλληλεπιδράσεις, οι αλλαγές συγκέντρωσης και οι διαδικασίες μεταφοράς σε ζωντανά κύτταρα να παρακολουθούνται ειδικά σε πραγματικό χρόνο. Οι 14 ερευνητικές ομάδες που συμμετέχουν στην προσφορά διερευνούν τις μοριακές και κυτταρικές φυσιολογικές επιδράσεις των φλεγμονωδών και αυτοάνοσων ασθενειών που επηρεάζουν το σχηματισμό και τη μετάσταση όγκων, τις κυτταρικές διεργασίες της νευρικής πλαστικότητας και την αυτοπεπεψία των κυττάρων (βλ. επισυναπτόμενες βιογραφίες). Οι στόχοι είναι ευρείς, αλλά το κοινό χαρακτηριστικό τους είναι ότι στοχεύουν στη διερεύνηση δυναμικών κυτταρικών βιολογικών αλλαγών στα ζωντανά κύτταρα. Τα προς προμήθεια μικροσκόπια παρέχουν τις απαραίτητες συνθήκες υποδομής για τις μελέτες και το εξαιρετικό επιστημονικό υπόβαθρο των συμμετεχόντων παρέχει την απαραίτητη πλατφόρμα γνώσεων για την εφαρμογή τους. Παρακάτω, οι μικροσκοπικές τεχνικές που θα χρησιμοποιηθούν παρουσιάζονται μέσα από μερικά κύρια θέματα. 1. Σε διάφορα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (π.χ. κοκκιοκύτταρα, μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα, λεμφοκύτταρα) διαδικασίες μετά τη σύνδεση των υποδοχέων, ο «διάλογος» μεταξύ των υποδοχέων παίζει κρίσιμο ρόλο σε πολλές φυσιολογικές και παθολογικές ανοσολογικές διεργασίες. Για παράδειγμα, η συνεργασία μεταξύ των υποδοχέων συμπληρώματος και των υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων για τα κοκκιοκύτταρα σημαντικά στη φλεγμονή, οδηγώντας στο σχηματισμό εξωκυτταρικών παγίδων ουδετερόφιλων (τα λεγόμενα NETs). Οι αλλαγές στο ενδοκυτταρικό σήμα Ca2+ που συνοδεύει την ενεργοποίηση ουδετερόφιλων μπορούν να ελεγχθούν με τη χρήση μελανιών δεικτών φθορισμού Ca (π.χ. Fluo3/Fluo4) και γενετικά κωδικοποιημένων δεικτών Ca2+ (π.χ. GCaMP6) τόσο σε συστήματα CLSM όσο και σε συστήματα SD για κυτταρικές σειρές ικανές να σχηματίσουν NET. Η μικροσκοπία TIRF που ενσωματώνεται στην SD είναι απαραίτητη για την παρακολούθηση της προσκόλλησης και της εξάπλωσης διαφόρων ανοσοκυττάρων και διεργασιών κοντά στην επιφάνεια των κυττάρων (π.χ. απελευθέρωση NET). Με τη χρήση συστημάτων CLSM και SD, ανιχνεύοντας ταυτόχρονα δύο φθορίζοντα σήματα, μπορούμε να ελέγξουμε τις μοριακές επιδράσεις που ελέγχουν τη λειτουργία των ανοσοκυττάρων (π.χ. αλληλεπίδραση μεταξύ υποδοχέων, ενδοκυτταρικές διαδικασίες μεταφοράς) σε πραγματικό χρόνο, σε κοντινή απόσταση από την κυτταρική επιφάνεια και παράλληλα με τη μέτρηση της ενεργοποίησης. 2. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός είναι ένας από τους πιο αποτελεσματικούς τρόπους για τη διόρθωση σφαλμάτων στο DNA των οργανισμών, την πρόληψη του μετασχηματισμού του καρκίνου και τη δημιουργία νέων γονιδιακών παραλλαγών. Εκτός από την προσέγγιση in vitro, δοκιμάζουμε σε ολόκληρους οργανισμούς (σκώληκα και zebrafish) DNA-HELICAS όπου υπο-επεξεργασίες της κυτταρικής διαίρεσης, μέσω ποιες μοριακές δραστηριότητες και με ποιους πρωτεϊνικούς εταίρους προωθούν τον ελεγχόμενο ανασυνδυασμό, ακριβή χρωμοσωμικό διαχωρισμό. Τα μικροσκόπια που επιτρέπουν την ταυτόχρονη και ταχεία απεικόνιση των δύο σημάτων φθορισμού είναι απαραίτητα για την ανίχνευση διεργασιών σε οργανισμούς που παράγουν πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε μηχανισμούς διόρθωσης σφαλμάτων με διαφορετικές ετικέτες φθορισμού. Ως εκ τούτου, η ανάλυση με συστήματα CLSM και SD συμπληρώνει τις μετρήσεις που πραγματοποιούνται με το ήδη υπάρχον μικροσκοπικό σύστημα δύο φωτονίων. 3. Τα τελευταία χρόνια, αναπτύσσοντας τεχνολογία μοριακών τατουάζ, έχουμε επιτύχει πρωτοποριακά αποτελέσματα στον τομέα της οπτικοαρμακολογίας. Με την ανάπτυξη ελαφρών ενεργοποιήσιμων φαρμακευτικών παραγώγων, έχουμε την ευκαιρία να ρυθμίσουμε ορισμένες κυτταρικές βιολογικές διεργασίε...