Rádi bychom získali dva komplementární mikroskopické systémy k provádění pozorování živých buněk, což umožňuje fyziologické vyšetření. Konfokální laserové skenování (CLSM) poskytuje vynikající příležitosti pro fluorescenční manipulace a měření (fotoaktivace, fotokonverze, fotobělení, Försterův rezonanční přenos energie (FRET)); specifičnost záznamu signálu se zvyšuje spektrální detekcí. V tomto systému můžeme testy zaměřit na menší oblasti v rámci zorného pole, volitelně označené. Díky mikroskopickému systému pro spřádání disků (SD) dokážeme zaznamenávat molekulární procesy v živých buňkách ještě rychleji než systém CLSM, a to i při milisekundové rychlosti záznamu obrazu v celém zorném poli. Důležitým aspektem je, že živé buňky jsou vystaveny menší světelné expozici během nahrávek, takže můžeme pokračovat v pozorování mnohem déle. SD systém, který má být pořízen, je také vhodný pro zobrazení molekulárních procesů v bezprostřední blízkosti povrchu buňky (ve vzdálenosti 100–150 nm) se zvýšeným rozlišením a vysokou rychlostí ve srovnání se zkouškami CLSM (TIRF, tj. plná vnitřní reflexní mikroskopie). Oba systémy jsou schopny zaznamenávat dva fluorescenční signály současně se dvěma detektory (CLSM) a dvěma kamerami (SD), takže molekulární interakce, změny koncentrace a transportní procesy v živých buňkách jsou specificky sledovány v reálném čase. 14 výzkumných týmů účastnících se výběrového řízení zkoumá molekulární a buněčné fyziologické účinky zánětlivých a autoimunitních onemocnění ovlivňujících tvorbu a metastázy nádorů, buněčné procesy nervové plasticity a vlastní trávení buněk (viz připojené životopisy). Cíle jsou široké, ale jejich společným rysem je, že se zaměřují na zkoumání dynamických buněčných biologických změn v živých buňkách. Mikroskopy, které mají být pořízeny, poskytují nezbytné infrastrukturní podmínky pro studie a vynikající vědecké zázemí účastníků poskytuje nezbytnou znalostní platformu pro realizaci. Níže jsou mikroskopické techniky, které mají být použity, prezentovány prostřednictvím několika hlavních témat. 1. V různých imunitních buňkách (např. granulocyty, makrofágy, dendritické buňky, lymfocyty) po ligandové vazbě receptorů hraje „dialog“ mezi receptory klíčovou roli v mnoha fyziologických a patologických imunitních procesech. Například spolupráce mezi komplementovými receptory a receptory rozpoznávání vzorů pro granulocyty důležité při zánětu, což vede k tvorbě neutrofilních extracelulárních pastí (tzv. NET). Změny intracelulárního signálu Ca2+ doprovázejícího aktivaci neutrofilů lze testovat pomocí fluorescenčních Ca-indikorových inkoustů (např. Fluo3/Fluo4) a geneticky kódovaných indikátorů Ca2+ (např. GCaMP6) na CLSM i SD systémech pro buněčné linie schopné vytvářet NET. TIRF mikroskopie integrovaná do SD je nezbytná pro sledování adheze a šíření různých imunitních buněk a procesů v blízkosti buněčného povrchu (např. uvolňování NET). Pomocí CLSM a SD systémů detekce dvou fluorescenčních signálů současně, můžeme testovat molekulární účinky, které řídí fungování imunitních buněk (např. interakce mezi receptory, intracelulární transportní procesy) v reálném čase, v těsné blízkosti buněčného povrchu a souběžně s měřením aktivace. 2. Homologní rekombinace je jedním z nejúčinnějších způsobů, jak opravit chyby v DNA organismů, předcházet rakovinné transformaci a vytvářet nové genové varianty. Kromě přístupu in vitro testujeme DNA-HELICAS na celých organismech (červ a zebrafish), ve kterých dílčích procesech buněčného dělení, prostřednictvím kterých molekulárních aktivit a s jakými proteinovými partnery podporují řízenou rekombinaci, přesnou chromozomální segregaci. Mikroskopy, které umožňují simultánní a rychlé zobrazení obou fluorescenčních signálů, jsou nezbytné pro detekci procesů v organismech produkujících proteiny, které se podílejí na mechanismech korekce chyb s různými fluorescenčními štítky. Analýza se systémy CLSM a SD proto doplňuje provedená měření s již existujícím dvoufotonovým mikroskopickým systémem. 3. V posledních letech jsme díky vývoji technologie molekulárního tetování dosáhli průlomových výsledků v oblasti optofarmakologie. S rozvojem lehkých farmaceutických derivátů máme možnost regulovat určité buněčné biologické procesy v systému CLSM lokalizací určitých mikrometrů. Procesy, které řídí dynamickou transformaci aktinových koster nervových buněk (např. růst a hledání cest axonů), mohou být prozkoumány s vysokým prostorovým a časovým rozlišením. Růst MyosinII axonu a actin dynamika toku
