We willen twee complementaire microscopische systemen verwerven om observaties op levende cellen uit te voeren, waardoor fysiologische onderzoeken mogelijk zijn. Het confocal laser scanning (CLSM) systeem biedt uitstekende mogelijkheden voor fluorescerende manipulaties en metingen (fotoactivering, fotoconversie, fotobleaching, Förster resonant energy transfer (FRET)); de specificiteit van de signaalopname wordt verhoogd door spectrale detectie. In dit systeem kunnen we de tests richten op de kleinere regio’s binnen het gezichtsveld, optioneel aangewezen. Met het spinning disc (SD) microscopisch systeem kunnen we moleculaire processen in levende cellen zelfs sneller registreren dan het CLSM-systeem, zelfs met een milliseconde beeldopnamesnelheid, in het hele gezichtsveld. Een belangrijk aspect is dat levende cellen tijdens de opnames minder licht worden blootgesteld, zodat we de waarnemingen veel langer kunnen voortzetten. Het aan te schaffen SD-systeem is ook geschikt voor het weergeven van moleculaire processen in de onmiddellijke nabijheid van het celoppervlak (binnen een afstand van 100-150 nm) met een hogere resolutie en hoge snelheid in vergelijking met CLSM-tests (TIRF, d.w.z. volledige interne reflectiemicroscopie). Beide systemen zijn in staat om twee fluorescerende signalen gelijktijdig op te nemen met 2 detectoren (CLSM) en 2 camera’s (SD’s), zodat moleculaire interacties, concentratieveranderingen en transportprocessen in levende cellen specifiek in realtime worden gevolgd. De 14 onderzoeksteams die deelnemen aan de tender onderzoeken de moleculaire en celfysiologische effecten van inflammatoire en auto-immuunziekten die tumorvorming en metastase, cellulaire processen van nerveuze plasticiteit en de zelfvertering van cellen beïnvloeden (zie bijgevoegde biografieën). De doelstellingen zijn breed, maar hun gemeenschappelijke kenmerk is dat ze gericht zijn op het verkennen van dynamische cel biologische veranderingen in levende cellen. De aan te schaffen microscopen bieden de nodige infrastructurele voorwaarden voor de studies en de uitstekende wetenschappelijke achtergrond van de deelnemers biedt het nodige kennisplatform voor de uitvoering. Hieronder worden de te gebruiken microscopische technieken gepresenteerd door middel van een paar hoofdthema’s. 1. In verschillende immuuncellen (bijvoorbeeld granulocyten, macrofagen, dendritische cellen, lymfocyten) na ligandbinding van receptoren, speelt „dialoog” tussen receptoren een cruciale rol in veel fysiologische en pathologische immuunprocessen. Bijvoorbeeld, samenwerking tussen complementreceptoren en patroonherkenningsreceptoren voor granulocyten die belangrijk zijn bij ontstekingen, wat leidt tot de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (zogenaamde NET’s). Veranderingen in het intracellulaire Ca2±signaal bij activering van neutrofielen kunnen worden getest met behulp van fluorescerende Ca-indicator inkten (bijv. Fluo3/Fluo4) en genetisch gecodeerde Ca2±indicatoren (bv. GCaMP6) op zowel CLSM- als SD-systemen voor cellijnen die NET kunnen vormen. TIRF-microscopie geïntegreerd in SD is essentieel om de hechting en verspreiding van verschillende immuuncellen en processen in de buurt van het celoppervlak (bv. NET release) te controleren. Door gebruik te maken van CLSM- en SD-systemen, door gelijktijdig twee fluorescente signalen te detecteren, kunnen we de moleculaire effecten testen die het functioneren van immuuncellen (bv. interactie tussen receptoren, intracellulaire transportprocessen) in realtime, in de nabijheid van het celoppervlak en parallel met de meting van activering controleren. 2. Homologe recombinatie is een van de meest effectieve manieren om fouten in het DNA van organismen te corrigeren, kankertransformatie te voorkomen en nieuwe genvarianten te creëren. Naast de in vitro benadering testen we in hele organismen (worm en zebravis) DNA-HELICAS waarin subprocessen van celdeling, via welke moleculaire activiteiten en met welke eiwitpartners ze gecontroleerde recombinatie, nauwkeurige chromosomale segregatie bevorderen. Microscopen die gelijktijdige en snelle weergave van de twee fluorescerende signalen mogelijk maken, zijn essentieel voor het detecteren van processen in organismen die eiwitten produceren die betrokken zijn bij foutcorrectiemechanismen met verschillende fluorescerende etiketten. Analyse met CLSM- en SD-systemen vult daarom de uitgevoerde metingen aan met het reeds bestaande tweefotonenmicroscoopsysteem. 3. In de afgelopen jaren, door de ontwikkeling van moleculaire tattoo technologie, hebben we baanbrekende resultaten op het gebied van optofarmacologie bereikt. Met de ontwikkeling van licht-activeerbare farmaceutische derivaten hebben we de mogelijkheid om bepaalde celbiologische processen in het CLSM-systeem te reguleren door bepaalde micrometers te lokaliseren. De processen die de dynamische transformatie van de actin skeletten van zenuwcellen (bijv. groei en zoeken naar paden van axonen) regelen, kunnen wor...